脊髓性（xìng）肌（jī）萎缩症（spinalmuscularatrophy，SMA）是一种常染色体隐（yǐn）性遗传病（bìng），居（jū）儿童致死性常染色（sè）体隐性遗传病的（de）第2位（wèi）。位于染色体5q11.2～q13.3上的运动神经元存活基因（Survivalmotorneuron，SMN）是SMA的主要致病基因（yīn）。

　　人基（jī）因组有两个紧邻的高度同源的SMN基因：端粒侧的SMN1和（hé）着丝粒侧的SMN2，两者仅有（yǒu）5个碱（jiǎn）基不（bú）同（tóng）。SMN1是主要功能基因（yīn），该基因突变可导（dǎo）致SMA发病，SMN2为临床表型的（de）调节基因，影响病情的严重（chóng）程度，其拷贝数增加可（kě）减（jiǎn）轻SMA表型。目前已知（zhī）约94％的（de）SMA患者为SMN1基因第（dì）7和（hé）（或）第8外显子纯合缺失（shī）所致，少（shǎo）数（shù）病例可由（yóu）SMN1基因（yīn）点突变或小的缺失（shī）引（yǐn）起。

　　SMN1基因外显子缺（quē）失检测的意义（yì）

　　SMA在（zài）人群中（zhōng）的发病率（lǜ）为（wéi）1/5000～1/10000，群体携带（dài）者频率为1/35～1/50，是出生缺陷的（de）高危因素（sù），因此（cǐ）极（jí）有必要（yào）进行（háng）SMA携带者的人群筛查，并通过产前诊断技术降（jiàng）低人群（qún）中SMA患（huàn）儿（ér）的出生率。

　　临（lín）床上将SMA分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，即（jí）婴儿型、中间型和少年型，严重程度依次递减。神经专科医（yī）生一般（bān）根据患者发病年龄、临床表现及病情（qíng）进展程度进行临（lín）床诊断（duàn），辅助检查方法包（bāo）括肌电图、肌酶和肌肉活（huó）检（jiǎn），结合家族史和（hé）SMN1基（jī）因分析可进行确诊（zhěn）。由于SMA患儿中（zhōng）约94%为SMN1基因（yīn）外显子纯合缺失，因此，SMN1基因（yīn）缺失检测对于（yú）SMA的诊断具有更（gèng）高的灵敏度和特异性。且对（duì）不同（tóng）型（xíng）的SMA患者，SMN1纯合（hé）缺失率没有显著（zhe）差异，所以，SMN1纯合缺（quē）失的检测对于不同型SMA患（huàn）者具有相同的临床诊断价值。在欧美人群中（zhōng），SMN1基因纯合缺失检（jiǎn）测已成为诊断（duàn）和排除诊断SMA的首选方法。

　　SMN1基因缺失检测试剂的（de）现状

　　目（mù）前，SMN1基因外显子缺失检测试剂（jì）较为缺乏，临床（chuáng）检验实验室较（jiào）为公认的方法是PCR结合（hé）限制性（xìng）片段（duàn）长度多态性（PCR-RFLP）的方法。但该方法操作较为繁（fán）琐，且重复性（xìng）差，不利于标准化，不易推广。同时，这种方法只能检测（cè）出纯合缺失，无法确认杂合缺失（shī）。

　　荷兰（lán）的SMAMLPA检测试剂可对待（dài）测（cè）靶序（xù）列进行半定（dìng）量（liàng）分析，因此既（jì）可检测纯合缺失（shī），亦可确认杂合缺（quē）失。在国（guó）内外已有多篇（piān）文献报（bào）道采用（yòng）该方法进行SMA患者诊断（duàn）和（hé）SMA携带（dài）者筛查。但该（gāi）产（chǎn）品（pǐn）目前仍为“仅用于研究”的试（shì）剂，尚未按照体外诊断（duàn）类（lèi）医（yī）疗器械上市（98/79/EC）。

　　2015年底，原国（guó）家食品药（yào）品监（jiān）管（guǎn）总局批准了第一项SMN1缺失突变检测试剂上市。该产品（pǐn）采用多重实时（shí）荧光MGB-TaqMan探（tàn）针PCR法，以人基（jī）因（yīn）组单拷贝（bèi）基因RPP40为内参基因，对SMN1基因（yīn）第7外显子和第8外显子拷贝数进（jìn）行相对定量检测（cè），用于SMA患者的体（tǐ）外辅助分（fèn）子诊断。SMN1基因外显子（zǐ）缺失检（jiǎn）测的难点之一在于排除高同（tóng）源性基因SMN2的干扰，特别是对于（yú）SMN2高拷贝数的受试者，需保证结果（guǒ）的准确可靠（kào）。该产品通过对实时荧光PCR相（xiàng）对定量（liàng）、绝对定量技术进行系统整合，并在反应体系中加入特定化学（xué）组分（fèn），以抑制PCR引物3’端的胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T）的错配（pèi），增加PCR扩增（zēng）的特（tè）异性，从而有（yǒu）效控制SMN2基因非特异（yì）性扩增对检测（cè）结果的（de）影响，准确检出高（gāo）拷贝数（shù）SMN2样本中SMN1基（jī）因（yīn）第（dì）7和（hé）第8外显子的缺（quē）失情（qíng）况。

　　鉴于国内外尚（shàng）无任何按照体外诊断试剂批准上市（shì）的（de）SMA分子诊断产品（pǐn），因此临床试验方案中依据EMQN关于《SMA分子诊断最佳实践指南》，采用了（le）国内外SMA体外（wài）辅助分子诊（zhěn）断领（lǐng）域公认的PCR-RFLP法作为对照方法。临床（chuáng）试验共完成（chéng）1069例，其（qí）中正常对照组（zǔ）777例，SMA病例组292例（lì），统（tǒng）计分析结（jié）果显示（shì）申报（bào）产品与（yǔ）对比方法检测结果的一（yī）致性为100%（95%置（zhì）信区间：99.66%～100%）。此外，9747例正常成年人大样本中目标外显子（zǐ）△△Ct分布范围的（de）调查亦显示，该产（chǎn）品的纯（chún）合突变（biàn）判断界值设置合理。

　　该试（shì）剂目前批准的预期用途仅（jǐn）包含纯合缺失的检测，尚不能用于（yú）杂合缺失（shī）的检测（cè），因此无法（fǎ）用于SMA携带者的筛查，这是该产品的缺（quē）陷之一。

　　事实上，该（gāi）产品在设（shè）计上已考虑到（dào）SMA携带者的检测，其检（jiǎn）测（cè）原理是（shì）以待测样本中（zhōng）目标外显子荧光（guāng）信号Ct值（zhí）与内参基因（yīn）荧光信号（hào）Ct值之差（△Ct_s），与正常对照品三个梯度（dù）稀释（shì）品（pǐn）中目标外显（xiǎn）子荧光信（xìn）号Ct值和内参基（jī）因荧光（guāng）信号Ct值之差的平均值（△Ct_a）之（zhī）差，即△△Ct，作为待测样本中目标外显子拷贝数检测变量（△△Ct=△Ct_s-△Ct_a）。根据实时荧（yíng）光定量PCR相对定量的基（jī）本数学原理推导得（dé）到（dào）申报产品检测变量△△Ct的计算（suàn）公式（shì），依据这一计算公式可推（tuī）导出纯合缺失、杂合缺失和野生型的（de）△△Ct理（lǐ）论值（或范围）；再结合目标（biāo）外显子与内（nèi）参基（jī）因（yīn）扩增效（xiào）率差异以及SMN2不同拷贝数的影响，可对上述△△Ct理（lǐ）论值进行优（yōu）化。结果显示纯合缺失、杂合缺失和野生（shēng）型的△△Ct值（或范（fàn）围）之间可（kě）设置合理（lǐ）的判断界值，因此理论上（shàng）该产品（pǐn）可分别检测（cè）出三种基（jī）因状态。但鉴于生产企业对（duì）杂合缺失与野生型之间的判断界值研究尚不（bú）透彻，再加上缺乏可（kě）判定杂合缺失（shī）的对（duì）比方法等其他困（kùn）难（nán），本次注册（cè）申请的（de）预期用（yòng）途（tú）仅限于检（jiǎn）测（cè）纯合突变，即SMA患者辅助诊断。

　　综上，SMN1基因外显（xiǎn）子缺失检测在SMA疾病诊断和SMA携带者（zhě）筛（shāi）查中具（jù）有重要的临床价（jià）值（zhí）。然而到目前（qián）为止（zhǐ），受到技术水（shuǐ）平的限制，相（xiàng）关的体外诊断试（shì）剂比较缺乏，特别是可用于SMA携带者筛查的杂合缺（quē）失（shī）检测，尚无适合（hé）的体外（wài）诊断试剂上市。（器审中心审评六部  何静（jìng）云（yún））

来源：中（zhōng）国（guó）医药（yào）报